Analyse des stéroides conjugués par LC-MS
Introduction
L’utilisation des stéroïdes androgéniques anabolisants (SAA) est très répandue dans le dopage depuis quelques dizaines d’années pour leurs effets positifs sur la musculature et la force physique. Ceci, malgré des effets secondaires non négligeables comme l’hypertension, l’hirsutisme, l’hypogonadisme, l’atrophie testiculaire ou la fragilité ligamenteuse. Les SAA les plus couramment utilisés à des fins de dopage sont la testostérone et la nandrolone et leur mise en évidence est effectuée par l’analyse de leurs principaux métabolites urinaires à l’aide de la chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS). Les métabolites retrouvés dans l’urine peuvent être sous forme libre ou conjuguée à des groupes polaires comme un groupe glucuronide ou un groupe sulfate. Ceci a pour but d’aider à l’excrétion de ces molécules par l’urine en augmentant leur hydrophilie. Ces métabolites ont pour caractéristique de pouvoir être d’origine endogène, c'est-à-dire produite naturellement dans le corps, ou exogène, c'est-à-dire issue d’une prise d’un produit à but thérapeutique ou à des fins de dopage. Actuellement, la mise en évidence d’un dopage à ces SAA est effectuée par la quantification des métabolites libres et glucuro-conjugués analysés sous forme libre après déconjugaison. Cette analyse est effectuée par GC-MS. Peu de données sont connues sur l’importance des métabolites excrétés sous forme sulfo-conjuguée. Une analyse directe des métabolites conjugués des stéroïdes endogènes par LC-MS/MS permettrait d’obtenir l’intégralité de l’information apportée par le métabolisme des SAA. Ceci permettrait également de mettre en évidence dans quelle mesure l’apport de l’analyse des métabolites sulfo-conjugués pourrait améliorer la détection d’un dopage à la testostérone ou à la nandrolone.
Objectif
Ce projet a pour but le développement et la validation de méthodes de quantification des métabolites glucuro- et sulfo-conjugués de la testostérone et de la nandrolone dans l’urine. L’application de cette méthode à des échantillons réels devrait permettre de conserver l’intégralité de l’information donnée par le métabolisme des SAA et ainsi mettre en évidence de nouveaux marqueurs éventuels d’une prise de SAA.
Méthode
Deux méthodes ont été développées et validées selon les critères recommandés par la Food and Drug Administration (FDA) et la Société Française des Sciences et Techniques Pharmaceutiques (SFSTP). La première permet la quantification des métabolites principaux de la nandrolone, il s’agit de la 19-norandrostérone et de la 19-norétiocholanolone, sous forme glucuro- et sulfo-conjuguée. Parallèlement, une autre méthode de quantification a été développée et validée pour les métabolites principaux de la testostérone (androstérone, étiocholanolone) ainsi qu’un précurseur (DHEA) et son épimère inactif (épitestostérone), sous forme glucuro- et sulfo-conjuguée.
Ces deux méthodes sont composées d’une préparation d’échantillon par extraction sur support solide muni d’une phase échangeuse d’anion qui permet une séparation en deux fractions. La première contient les métabolites glucuro-conjugués et la seconde, les métabolites sulfo-conjugués. Les premiers sont ensuite analysés par GC-MS après hydrolyse et dérivation alors que les seconds sont analysés par LC-MS/MS sur une trappe à ions.
Résultats et conclusion
Les deux méthodes décrites ici ont été validées et appliquées à des échantillons biologiques issus d’une étude clinique impliquant la prise orale de norandrostènedione (un précurseur de la nandrolone) ou de testostérone.
La prise orale de norandrostènedione influence de manière significative l’excrétion des métabolites glucuro- et sulfo-conjugués de la nandrolone dans l’urine. Il est à noter que l’un des métabolites sulfo-conjugué de la nandrolone, la 19-norandrostérone sulfate, est le métabolite urinaire qui a été retrouvé le plus longtemps (200h) après la prise de produit dopant. L’analyse de ce métabolite pourrait permettre d’élargir la fenêtre de détection d’une prise de norandrostènedione. Par contre, à basse concentration, il n’a pas été possible de mettre en évidence un marqueur capable de discriminer l’origine des métabolites de la nandrolone, endogène ou exogène. Ceci aussi bien en se basant sur les niveaux de concentrations urinaires que sur l’évolution des rapports de concentrations. Or il existe une méthode capable de discriminer l’origine des métabolites de la nandrolone basée sur l’analyse de la composition isotopique du carbone par l’utilisation de la spectrométrie de masse de rapports isotopiques (IRMS). A l’aide de la méthode présentée ici, il serait donc possible d’isoler la 19-norandrostérone sulfate est d’en déterminer l’origine grâce à l’analyse isotopique, ce qui pourrait potentiellement élargir la fenêtre de détection d’un dopage à la norandrostènedione orale. Mais cette hypothèse doit encore faire l’objet de recherches.
La prise orale de testostérone influence également les niveaux de ces métabolites urinaires ainsi que leur rapport de concentration. Malgré ceci, il n’a pas été possible de mettre en évidence un marqueur d’une prise de testostérone plus sensible que les marqueurs utilisés actuellement. Par contre, l’influence sur les métabolites sulfo-conjugués montre que ces métabolites sont d’importance et doivent être incorporés dans une approche de type métabolomique pour la mise en évidence d’un dopage aux SAA endogènes comme la testostérone.
Publications
Strahm E, Rudaz S, Veuthey J-L, Saugy M, Saudan C. Profiling of 19-norsteroid sulfoconjugates in human urine by liquid chromatography mass spectrometry. Analitica Chimica Acta 613 (2008) 228-237
Strahm E, Kohler I, Rudaz S, Martel S, Carrupt P-A, Veuthey J-L, Saugy M, Saudan C. Isolation and quantification by high-performance liquid chromatography -ion-trap mass spectrometry of androgen sulfoconjugates in human urine. Journal of Chromatography A 1196-1197 (2008) 153-160
Strahm E, Baume N, Mangin P, Saugy M, Ayotte C, Saudan C. Profiling of 19-norandrosterone sulfate and glucuronide in human urine: implications in athlete’s drug testing. Steroids 74 (2009) 359-364
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